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产品时间：2021-11-24
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简介: 与生物治疗分子相连的聚乙二醇聚合物可以提高这些大分子量药物的体内释放和稳定性。然而，这些聚合物本身可能具有免疫原性，并且可以诱发抗体，从而降低药物的功效，导致潜在的病人发病率。建立了一种双抗原桥接 elisa 免疫原性检测方法，用于检测不同尺寸聚乙二醇聚合物特异性的抗药性抗体。方法: 合成40kda 聚乙二醇半抗原标记偶联物，用于双抗原桥接 elisa 检测。半抗原标记的栓子与患者样本孵育，然后将这种混合物加入预涂有40kda 栓子的96孔微孔板中，使栓子特异性 ada 与栓子共轭物和栓子涂在微孔板上形成桥接复合物。孵育后，去除反应混合物，代之以辣根过氧化物酶标记的抗半抗原抗体。充分培养后，洗净平板，加入底物试剂。酶的颜色发展与 ada 成正比，在2n 硫酸作用下20min 后停止，每个吸光度在450/630nm 处测量。对350份正常人血清进行了剂量反应、耐药性、基质效应、重复性、特异性/非特异性药物耗竭试验和筛选切点测定。结果: 以抗钉鼠单克隆 igm 为阳性对照，建立了钉鼠免疫原性 elisa 的重复性剂量反应曲线。在总共350名天真捐赠者中的15份人血清样本中发现了已存在的 peg 特异性抗体，这些抗体被证明对 peg 聚合物结构具有高度特异性。该方法没有显著的基质效应，重复性很好。讨论: 一个双抗原桥接免疫原性试验检测抗体钉在典型的聚合物 siz
1. 介导免疫原性试验检测循环抗药性抗体(adas)已成为生物治疗学研究的重要手段，因为这些高分子重量药物可引起潜在的有害免疫反应，影响药物的疗效和安全性。在许多策略中，这种大分子的潜在免疫原性可以通过附加聚乙二醇(peg)聚合物来减少。聚乙二醇与药物或治疗蛋白的共价连接可以保护生物治疗免受宿主免疫系统的影响，通过掩盖其免疫原性表位来降低其免疫原性，同时通过增加药物的流体动力学大小来延长药物的循环半寿命，从而减少肾间隙。Peg 由于其结构和低电荷密度，一直被认为是不具有免疫原性的，但直到最近，这种观点大多是轶事性的。基于单独的大小，聚乙二醇聚合物在分子大小范围内通常用于药物设计(10至40千达)是潜在的免疫原性。Richter 和 akerblom (1983,1984)在用聚乙二醇化蛋白免疫的动物中成功地产生了抗聚乙二醇抗体，1984年，在第一种聚乙二醇化药物获得批准之前，已经报道在人体中存在抗聚乙二醇抗体。他们计算出0.2% 的健康人群有抗 peg 抗体，这些抗体大部分是 igg。他们还得出结论，为了用聚乙二醇化过敏原进行减敏治疗，这些抗体并不构成重大问题。根据后来 leger 等人(2001年)、 armstrong 等人(2003年)和 garratty 等人(2004年)的研究，抗 peg 抗体在健康人群中的发生率要高得多(22-25%)。此外，诱导 peg 免疫并不像最初认为的那样无害。 gansonet al. (2006)报告说，与未免疫的患者相比，用聚乙二醇化酶治疗难治性 goutsulted 的患者产生 peg 特异性抗体的清除率更高。Armstrong 等人(2007年)报告了在 peg-immune 淋巴细胞白血病患者接受 peg 化天冬酰胺治疗时快速清除药物的相似结果。这两个例子中的抗 peg 抗体的存在都会增强给药药物的有效性。事实上，几个动物的 igm 和 igg 抗体现在已经成功地开发针对 peg 聚合物的进一步证明了这些结构的免疫原性[ cheng et al. (2000) ，cheng et al. (2005)]。因此，检测与生物治疗分子相关的 adas 是药物安全研究的必要组成部分，需要一种普遍适用于所有聚乙二醇化蛋白质药物的标准方法。双抗原桥接免疫原性酶联免疫吸附试验(elisa)已成功地应用于该领域。该方法可以检测到不同长度的聚乙二醇聚合物抗体，并附有不同的官能团，是检测任何聚乙二醇生物治疗产生的聚乙二醇特异性抗药性抗体的一种有潜力的通用方法。图2。材料和方法。采用 anp 技术制备了ー40kda 聚乙二醇偶联物，制备了抗 peg 鼠单克隆 igm (anpeg-1)抗体，并以40kda 聚乙二醇作为免疫原制备了 anp 拥有属性。校准品是在一个天真的人血清库中，通过连续稀释这种抗体制备的。用 anptechnologies 公司的 peg (40kda)涂层96孔微孔板制备了化验稀释液(pbs 缓冲液加 hama 阻断剂)和化验洗涤缓冲液(pbs 加洗涤剂) ，并用 anp 技术制备了共轭小鼠抗半抗原抗体，用 anp 技术从 moss 公司的停止液(硫酸，2.0 n)中购买了化验稀释液(tmb) ，从 vwr 公司2.2中获得了化验稀释液(2.0 n)。Elisa 方法的优化 elisa 方法的优化是通过测试两种可能的捕获配置，40kda 聚乙二醇直接涂在平板上或生物素标记版涂在链霉亲和素活化平板上。采用生物素化聚乙二醇修饰的链霉菌素平板进行测定，结果表明，采用生物素化聚乙二醇修饰的链霉菌素平板具有较好的信号动力学范围。将构成桥配合物另一半的半抗原标记药物与样品混合，加入生物素聚乙二醇固定的微孔中，然后与 hrp 标记的抗单克隆抗体反应。优化了两种标记物的浓度和检测孵育时间，以获得最佳灵敏度和信号动态范围。用半抗原标记和生物素化药物预孵化血清样品，然后加入包被良好的二价链霉亲和素或小鼠抗半抗原抗体的检测方法，灵敏度和动态范围均不理想。将生物素化聚乙二醇预涂于链霉菌抗生素涂层平板上，获得了最佳的灵敏度和信号范围。
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