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产品时间：2021-11-25
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什么是细胞外囊泡？
细胞外囊泡 (EV) 是由细胞分泌的膜结合小颗粒，被认为具有细胞信使的功能，将货物从一个细胞运送到另一个细胞。电动汽车有多种亚型，其功能、货物和尺寸各不相同，直径范围为 ~30-1000 nm。最小的 EV 类型是外泌体，大小约为 30-150 nm。EV 起源于称为多泡体 (MVB) 的细胞区室，其本身源自内体的内陷。当 MVB 与质膜融合并释放其货物时，囊泡被释放。
在生物医学研究中，外泌体及其货物被用作癌症和其他疾病的诊断生物标志物。EV 和外泌体可以使用超速离心、PEG 沉淀和免疫捕获珠等技术从血液或其他生物体液中分离出来。
外泌体膜含有源自原始细胞质膜的跨膜蛋白，通常包括四跨膜蛋白家族的蛋白质（如 CD9、CD63 和 CD81）。在内部，外泌体包含细胞质成分，如蛋白质和 RNA。可以使用 RNAseq、蛋白质印迹和流式细胞术等方法分析外泌体成分。为了通过流式细胞术进行表征，研究人员可以使用染料对膜和核酸等外泌体成分进行染色，以及与四跨膜蛋白或其他感兴趣的蛋白质结合的抗体。
外泌体分析：小目标，大挑战
外泌体的小尺寸使其难以处理和分析。在流式细胞术中，外泌体很难与细胞碎片和其他小颗粒区分开来，它们的大小处于或低于某些流式细胞仪的灵敏度极限。用某些染料或抗体染色有助于区分外泌体和其他颗粒。然而，使用不会形成聚集体的染色剂很重要，因为这些小颗粒本身可能会与染色的外泌体混淆。这种聚集体一直是外泌体研究人员的挫败感。
在分析之前用于富集或纯化 EV 的方法也是一个重要因素。富含简单 PEG 沉淀步骤的样品通常含有大量非 EV 脂质颗粒，这些颗粒也可能与膜染料结合。这些杂质可以通过使用其他 EV 纯化方法来减少，例如尺寸排阻色谱 (SEC) 或免疫沉淀。与抗四跨膜蛋白抗体结合的磁珠可以产生纯外泌体簇。然而，这些珠子可能会与许多疏水性染料（例如膜染料）非特异性结合。
我们已经筛选了大量我们的抗体和染料，以寻找那些既能很好地染色外泌体，又表现出极少或没有聚集（即在没有外泌体的情况下发出信号）的抗体和染料。继续阅读下文，探索我们经过验证的 EV 抗体和染料。
EXOBRITE™ EV 膜染色试剂盒
ExoBrite™ EV 膜染色试剂盒旨在克服外泌体检测的一些挑战。ExoBrite™ 染料与外泌体膜中的分子结合，通过流式细胞术为分离的 EV 提供明亮、特异性的染色。ExoBrite™ 染料的一个关键优势在于，与许多其他染料不同，它们几乎没有或没有与外泌体或 EV 大小相似的背景聚集体。此外，与大多数膜染料不同，ExoBrite™ 染料不会非特异性结合聚苯乙烯珠粒，这意味着它们可用于染色珠粒结合的外泌体。
ExoBrite™ EV 膜染色剂已在流式细胞术中得到验证，能够对来自多种不同培养细胞系的外泌体和 EV 进行染色，并通过多种不同方法进行分离，包括尺寸排阻色谱 (SEC)、聚乙二醇 (PEG) 沉淀和磁珠免疫沉淀 (IP)。
ExoBrite™ EV 膜染色优点：
专为外泌体染色设计和配制
极低的背景可提供出色的信噪比
能够与抗体共同染色（不同于 CellBrite® Fix 或 MemBrite® Fix）
能够与珠结合外泌体一起使用（与大多数其他膜染料不同）
来自 MCF-7 细胞的珠结合外泌体的流式细胞术。未染色的外泌体（灰色）或与 10X ExoBrite™ 490/515 和 CD9(H19a)-CF®568（粉色）共染色。在 FITC 和 R-PE 通道中的 CytoFLEX LX 流式细胞仪上检测到外泌体。
ExoBrite™ EV 膜染色/抗体共染色
ExoBrite™ EV 膜染色剂的一项优势是能够与抗体共染色，用于外泌体蛋白质分析研究。共染色可以同时或顺序进行，并且可以在纯化的或珠结合的外泌体上进行。ExoBrite™ EV 膜染色剂是通用外泌体染色剂，应标记样品中的所有外泌体*，允许使用抗体来量化表达目标蛋白质的外泌体数量。例如，在我们测试的外泌体（MCF-7 衍生）中，四跨膜蛋白 CD9 高度且无处不在地表达。** 我们发现，当我们与 ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 和 CD9（ H19a)-CF®488A，它们的阳性群体几乎*重叠（见图，右）。
纯化外泌体最佳 ExoBrite™/抗体共染色的提示：
使用 10X ExoBrite™ 对 1 mL 中纯化的外泌体进行染色（ExoBrite™ 染色在同时共染色期间会有所减少，因此不建议使用 1X）
尝试从至少 0.1 ug/mL 的抗体开始
*在我们测试的外泌体中，ExoBrite™ EV 膜染色剂标记了所有外泌体。可能存在具有不同染色水平的外泌体类型。
**四跨膜蛋白（CD9、CD61 和 CD81）和其他蛋白质的表达水平在细胞类型和外泌体来源之间差异很大。
SEC 纯化的 MCF-7 衍生外泌体同时使用 1 mL 10X ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 和 0.1 ug/mL CD9(H19a)-CF®488A 染色。当对 ExoBrite™ 560/585 阳性颗粒进行门控时，约 95% 的 CD9 也呈阳性（顶行）。同样，当对 CD9 阳性颗粒进行门控时，约 95% 的 ExoBrite™ 560/585 也呈阳性（底行）
经验证的外泌体抗体
用作外泌体标志物的最常见蛋白质是四跨膜蛋白家族的成员 CD9、CD63 和 CD81。四跨膜蛋白是具有许多拟议功能的质膜蛋白，包括其他膜蛋白的活化和分选。它们还被认为在将蛋白质靶向多泡体 (MVB) 和外泌体方面发挥作用。这些四跨膜蛋白在许多细胞类型上广泛表达，因此可以在许多类型的外泌体上检测到，但它们的表达水平确实因细胞来源类型而异。
EV 中经常检测到的其他蛋白质包括热休克蛋白（即 HSP70）、膜运输蛋白、MVB 生物发生蛋白（即 Alix、TSG101）和细胞粘附分子（即 Ep-CAM、ICAM-1）。Ep-CAM 主要在上皮细胞中表达，包括细胞系 MCF-7。
Biotium 提供多种不同的针对外泌体标记蛋白的抗体克隆，每种都有多种偶联物选择，例如亮 CF® 染料和生物素。下面列出的抗体已通过流式细胞术专门验证用于外泌体检测，使用富集的 MCF-7 衍生的 EV，结合 CD63 特异性磁珠 (Thermo Fisher Scientific)。
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