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媒体

1. 混合 B27 补充剂 / Neurobasal 培养基 / 0.5 mM 谷氨酰胺后，培养基能稳定多久？

我们在 4 o C 的黑暗中储存长达 6 个月。

2. 我需要多久补充一次 Neurobasal/B27/谷氨酰胺？

我们每 3 到 4 天更换 1/2 培养基，但这部分取决于细胞密度。参见 INVITROGEN (LTI) FOCUS 16:6。如果细胞密度高于 500/mm 2  ，则每 2 天更换 1/2。

3. 我可以用一些 B27/Neurobasal + 谷氨酰胺（无谷氨酸盐）稀释 BrainBits 附带的 B27/Neurobasal + 谷氨酰胺 + 谷氨酸盐，比如 1:2 稀释，细胞仍然生长吗？

是的，但也不是。请参阅上面引用的 FOCUS 文章。

4. 您通常在培养第 4 天之前向 Neurobasal/B27 添加 25 uM 谷氨酸盐。谷氨酸的目的是什么？

它帮助海马神经元发芽并促进活力。

5. 不加谷氨酸有问题吗？

在 4 DIV 时，您的存活率将降低约 30%。

6. 我需要一些培养基或试剂来维持培养物吗？

您将需要您选择的镀膜玻璃或塑料基板。该订单包括足够的培养基来开始培养并维持 4 或 5 天。除此之外，您将需要更多培养基，我们可提供完整的即用型 NbActv1 配方，并通过 Invitrogen 单独提供。

7. 我应该用抗生素/抗真菌剂补充 B27/Neurobasal 培养基吗？例如：pen/strep/fungizone 或庆大霉素？

我们通常在不使用抗微生物抗生素和抗真菌剂的情况下进行培养，并取得了良好的效果。这具有三个优点：

首先，当出现污染时，更容易确定污染源。其次，如果您使用抗生素，当您感染时，就更难摆脱。第三，抗生素已被证明可以激活神经元中的癫痫样爆发活动。然而，我们有时会在庆大霉素 (10 ug/ml) 中开始培养，并在细胞粘附后一小时后将其冲洗干净。

休眠®

*Hibernate、Neurobasal 和 B27 仅用于研究目的，由 Invitrogen Corporation 制造。Hibernate、Neurobasal 和 B27 是 Invitrogen Corporation 的商标。

1. 我可以使用Hibernate进行木瓜蛋白酶治疗吗？

BrainBits LLC 提供 5 ml 不含 B27 的 Hibernate-Ca，用于在 15 ml 无菌离心管中以最佳方式将 BrainBits 与木瓜蛋白酶解离。添加木瓜蛋白酶 (Worthington) 后，在 37 o C 下溶解10 分钟。您需要使用 0.2 µm 过滤器对溶液进行消毒。

2. 你是否总是在 Hibernate 中添加 B27 谷氨酰胺，或者它是否仍然在 Hibernate 中保持细胞存活？

几乎总是。请参阅 Brewer and Price (1996) PM:8856709 的图 1 在 37 0 C 环境 CO2 中，Neurobasal/B27/gln 中的 LD50 为 24 小时，休眠/B27/gln 中为 >3 天。

3. 我们可以提供不含葡萄糖和丙酮酸的 Hibernate 吗？

是的，事实上我们有几个客户提出了这个要求。因此，我们可以以相同的价格提供不含葡萄糖和丙酮酸的 Hibernate A。您只需要告诉我们您是希望用 NaCl 将渗透压调整到正常水平还是低于平常水平，以便您可以自行调整。

4.  Hibernate 的其他用途包括：

转基因小鼠基因分型过程中的大脑储存

将脑组织运送给合作者

基质

1. 我不经常使用聚-D-赖氨酸。我制作了 5 毫克/毫升的 (100x) 储备溶液并将其等分到小冷冻管中。我可以将原液冷冻保存多久，并且仍然可以与海马细胞一起使用？

大概是永远。不要储存在聚丙烯管中。聚苯乙烯或 PET 更好。解冻时一定要搅拌均匀。

2. 一些研究人员使用聚乙烯亚胺代替聚赖氨酸。一个比另一个有优势吗？

PEI 比聚赖氨酸便宜。我们使用 PEI 并没有取得多大成功，但 Mark Mattson 在开始在 Neurobasal/10% 血清中培养后一直使用它。报告表明神经元存活率或尖峰率没有显着差异。

Soussou WV、Yoon GJ、Brinton RD、Berger TW (2007) 在表面处理的多电极阵列上培养的海马神经元的神经元网络形态学和电生理学。IEEE 跨生物医学工程 54：1309-1320。 电话：17605362

Brewer GJ, Cotman CW (1989) 海马神经元在低密度限定培养基中的存活和生长：夹心培养技术或低氧的优势。大脑研究 494:65-74。电话：2765923

3.  BrainBits 神经元越来越多地生长为细胞簇或团块，而不是孤立的。怎么了？

这意味着细胞与自身的粘附比与基底更紧密。最可能的问题是基材准备不充分。将您的方案与推荐的聚赖氨酸制备和基材涂层进行比较。

4. 关于聚-L-赖氨酸与聚-D-赖氨酸，我假设使用聚-D-赖氨酸，因为如果它分解成赖氨酸，细胞就不能使用d-赖氨酸。有什么道理吗？

这就是理论。在一些早期研究 (Brain Res. 494:65(1989)) 中，我们发现差异很小。

BRAINBITS® 纸巾

1. 我假设 BrainBits 来自新生动物？

除非另有说明，否则它们来自胚胎第 18 天的大鼠。

2. 皮层培养不包括海马体，对吗？

他们可以，但我们准备了没有丘脑或海马体的 E18 皮层。我们可以通过特快专递提供海马组织或皮质组织。这些“BrainBits"允许在 20 分钟内为超过 100 万个海马神经元或 200 万个皮质神经元准备细胞，价格为 136 美元。

3. 每个小瓶可以来自皮层和海马体的神经元数量是多少？

海马神经元的神经元数量>100 万或皮质神经元的 200 万。

4. 海马神经元什么时候表现出兴奋性毒性？

乙酰胆碱在我们所知的任何年龄都没有毒性。

从 E18 海马培养 7 天开始，谷氨酸的毒性最大。皮层神经元可能会提前 1 或 2 天。

5. 你知道你从皮质和海马体中每瓶提供多少个星形胶质细胞吗？

从海马开始的星形胶质细胞数量>100万，皮层>200万。

6. 动物脑和脊髓组织是根据 NIH 批准的方案获得的，有哪些保证？

BrainBits 动物协议 #32-08-013 于 11 年 5 月 18 日获得南伊利诺伊大学医学院实验动物护理和使用委员会的批准。

对于 NIH 资助，脊椎动物部分：

保证编号为 A-3209-01

F. 脊椎动物

用于原代培养的海马、皮层和其他脑和脊髓神经元将从胚胎或出生后早期大鼠或小鼠的脑中获得。在用氟烷（小鼠）或 IP 五巴比醇（大鼠）麻醉后解剖大脑。

通过从动物中分离神经元，可以研究比整个动物研究更多的实验变量，从而减少对动物的需求。大鼠和小鼠的大脑是所有动物大脑中研究得好的。

平均住房需求估计为 2 天，足以让啮齿动物从运输创伤中恢复过来。动物将由 AALAC 认可的 SIUSM Laboratory Animal Medicine 进行护理，并在 Teresa Liberati、DVM、Ph.D. 的指导下拥有 10 名员工，并获得 ACLAM 认证。

用氟烷或麻醉后解剖大脑。因此，这些程序将动物的使用限制在进行具有科学价值的研究中无法避免的范围内，并最大限度地减少动物的不适、痛苦和疼痛。

用氟烷麻醉后将解剖大脑。将用于大鼠的心脏。小鼠将在麻醉下断头台。这些方法符合美国兽医协会小组的建议。

7.  BrainBits, LLC 能否从我们胚胎大鼠和小鼠的怀孕母亲那里获得解剖区域？

BrainBits 可以从我们胚胎大鼠或小鼠的怀孕母亲那里提供大脑皮质。这是一个建议的协议，供您评估是否要尝试此操作。请告诉我们您是否以及何时希望 BrainBits 开始向您发送成人皮质以分离内皮细胞。

Wolburg H、Neuhaus J、Kniesel U、Krauss B、Schmid EM、Ocalan M、Farrell C、Risau W (1994) 血脑屏障内皮细胞紧密连接结构的调节。组织培养、第二信使和共培养星形胶质细胞的影响。J Cell Sci 107（第 5 篇）：1347-1357。 电话：1692329

Risau W、Engelhardt B、Wekerle H (1990) 血脑屏障的免疫功能：体外大鼠脑微血管内皮对蛋白质（自身）抗原的不*呈递。J Cell Biol 110:1757-1766。 电话：7929640

有关从脊髓中分离运动神经元的更多信息 M. Das、JW Rumsey、N. Bhargava、M. Stancescu 和 JJ Hickman。定义的长期体外神经肌肉接头组织工程模型。生物材料 31 (18):4880-4888, 2010.  PM:20346499

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解散

1. 通过结核菌素注射器上的 18 或 20 号针头研磨组织是否有问题？

是的。针的边缘太锋利了。1 ml 移液管的蓝色塑料吸头更好，但好的是火焰抛光的 9 英寸巴斯德移液管，该吸管之前经过硅烷化处理。确保吸头开口的直径至少为 1 毫米。

2. 海马或皮层细胞的活力是否取决于解离方法？你更喜欢机械解离还是酶解离？

是的，使用木瓜蛋白酶可以获得更高的活产率（参见 J Neurosci Meth 71:143），但表面蛋白的消化是不可避免的。短期（少于 4 天）这是一个问题。从长远来看，它可能并不重要。使用火抛光的 9 英寸玻璃移液管获得更高的生存能力，使用蓝色塑料移液管获得更低的生存能力。对于 E18 组织，我们使用机械来提高速度和简单性。

3. 您是否使用酶来制备皮质培养物？

为了获得更高的产量，我们使用 在不含 B27 的H ibernate E-Ca 中稀释的 2 mg/ml木瓜蛋白酶溶液 。该溶液应在 30 o C 水浴中孵育10 分钟。不应在此溶液中添加其他化学品，例如 EDTA、巯基乙醇或半胱氨酸-HCl。有关其他信息，请参阅我们的 原代神经元细胞培养方案 。

4. 您为什么推荐不含 B27 的 Hibernate-Ca 以实现与木瓜蛋白酶的最佳解离？

钙促进粘附。因此，去除钙会促进神经元的解离。为了提供细胞粘附蛋白作为木瓜蛋白酶的主要底物，B27 被省略，因此 B27 中的蛋白质不会竞争底物。

文化

1. 细胞能存活多少代和多长时间？

如果您每 3-4 天以一半的培养基体积变化来喂养细胞，它们将持续数月。由于它们不会繁殖，因此通过它们是没有意义的。

2. 它包含多少个星形胶质细胞？

海马体 BrainBits 中的星形胶质细胞少于 5%。皮质 BrainBits 可能有大约 10% 的星形胶质细胞。如果你在血清中培养，你会得到更多。我们推荐在 B27/Neurobasal (Invitrogen/GIBCO) 中培养。这抑制了没有 AraC 的神经胶质生长。

3. 我什么时候应该添加 Ara-C 作为星形胶质细胞的有丝分裂抑制剂？

在我们推荐的 Neurobasal/B27 培养基中，您根本不需要添加 Ara-C。该培养基不像血清那样人为地刺激星形胶质细胞增殖。尝试一下！

4. 我用 BrainBits 开始的培养物被污染了。开始时它们看起来很好，但现在介质是混浊的黄色，有许多 1-3 um 长的相暗体。

至少有 5 种可能的污染源（假设您的培养箱中的其他培养物没有受到污染，并且培养箱底部的加湿水是清澈的）：

培养容器本身。通过将新鲜过滤的培养基添加到多个培养容器中进行控制。

粘合剂基材。这并不少见。BrainBits 已准备好无菌底物盖玻片供您测试。您还可以将新鲜过滤的培养基放在准备好的基质上，以寻找这种污染源。

培养基本身或其添加剂之一（例如，谷氨酰胺）。这并不少见。确保在您的培养基的未涂层孔中进行单独的测试，并由 BrainBits 提供。

看似随机或低水平的污染可能来自于朝着开放文化的方向说话甚至呼吸。此外，无菌罩和培养箱之间的空气不是无菌的，大多数培养容器没有密封。如果引擎盖到培养箱的距离很远，您可以将您的培养物放在已用 70% 乙醇冲洗过的塑料食品容器中。

BrainBits 组织。尽管我们对我们提供的培养基进行了无菌测试，但无法对组织本身进行测试。如果您能提供证据证明您的 BrainBits 组织按时到达并在 4 摄氏度下储存直至使用，并且上述 4 种可能性已被排除，请致电我们进行一次性更换。通常，我们的经验是您的样品是我们本周所有货物中受到污染的样品，因此请理解我们需要进行上述测试。

5. 我想知道您是否可以建议我需要接种多少个细胞才能获得足够的蛋白质用于几次蛋白质印迹，即多少个细胞等于 20-50 ug 蛋白质？

根据 Patel 和 Brewer (2003) 的说法，在培养中生长一周的每 18,000 个细胞含有约 6 微克蛋白质。因此，3000 个细胞/微克蛋白质。需要约 50 微克蛋白质的蛋白质印迹提取物将需要约 150,000 个细胞。

冷冻细胞

1. 我尝试用 1:1 稀释来自新鲜解冻的冷冻神经元的台盼蓝进行活力染色。所有细胞似乎都染成淡蓝色。

这是可以预料的，因为冷冻保护剂会部分渗透膜。非常轻柔地处理这些刚解冻的细胞。在培养几个小时后或肯定在 15 小时后，与竞争对手的冷冻细胞相比，这些细胞中有更多的细胞将*排除台盼蓝作为生存力的指示。您还可以尝试使用 5 ug/mL 的红色荧光染料碘化丙啶对死细胞进行染色。

NBACTIV4®

1. 你能告诉我关于生长条件的改善以及我需要哪些补充剂（例如谷氨酰胺等）来用这种新培养基培养和生长初级 E18 皮质神经元？

您可以像通常使用 Neurobasal/B27 和 0.5 mM Glutamax 的混合物一样使用新培养基，因为所有这些成分都在新混合物中 + 3 种新成分；胆固醇、雌激素和肌酸。

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预涂培养瓶

1. 你能推荐任何品牌的预涂组织培养瓶或制备用于原代神经元生长的组织培养瓶的方法吗？

BrainBits 已确定细胞培养塑料或玻璃上的聚赖氨酸涂层在涂层后 2 天内开始失效。我们怀疑一些预涂板的效果令人满意，但我们的经验是，其中一些导致原代神经元的粘附和存活不佳。因此，我们建议您涂上自己的基材并在一天内使用它们，如提供的协议中所述。

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祖先

1. 为什么我会立即看到集群形成？

以 30,000/cm 2接种细胞 将导致快速簇形成。如果没有附着，它们将作为前体留在 Neuropro 中并长成可在 4-7 天内收获的神经球。4 天后可以开始对巢蛋白或其他抗体进行免疫染色评估。要查看克隆生长，您可以将原始样品或这些神经球以 50 个细胞/cm2 的组织培养塑料或超低粘附塑料的有限稀释度铺在同一培养基中。

为了观察多能性，在涂有聚-d-赖氨酸（50 微克/毫升水）的基材上以 5 到 15,000 个细胞/cm2 的浓度将神经球平板分离。

2. 我应该接种单个细胞来做神经球检测吗？

不，神经球包含一组细胞。您可以将它们固定并作为簇染色或用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶将它们分离，计数以确定产量和/或固定以评估单个细胞。

3. 接种后细胞为单个细胞，但今天已形成簇。一些集群的大小非常大。这是正确的标志吗？

是的。

4. 我应该观察神经球的形成来评估细胞的祖细胞阶段吗？

不，至少等待 4 天。

5. 如何区分神经球和簇？

您可以将神经球传递到低粘附性塑料或粘附性表面上并观察差异。只要细胞在低粘附性塑料上，它们就会作为祖细胞留下。

6. 这个阶段需要做免疫染色吗？

至少等待 4 天。

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