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DCypherTM: 以高灵敏度和特异性询问染色质读数器鉴定和评估读数器与核小体结合的测定 epicypher产品测定 epicypher产品测定

概述: 询问染色质阅读器表观遗传阅读器蛋白因其在细胞功能中的重要作用以及靶向药物开发治疗癌症等疾病的潜力而受到广泛关注。经典的方法依赖于组蛋白肽拉降序列来询问染色质阅读器的结合偏好1。然而，这些方法由于低灵敏度和/或高背景而受到高失败率的困扰。这对于解决低亲和力相互作用特别有问题，因为阅读器蛋白在微摩尔范围内具有解离常数(Kd)是常见的。此外，线性肽不能概括在三维核小体结构的背景下发生的体内相互作用。为了解决这些问题，EpiCypher 已经开发了一个敏感和强大的发现平台，以利用含有不同翻译后修饰(PTM)的多种重组核小体来询问染色质阅读器的结合，组蛋白变体，突变和/或 DNA 甲基化状态。DCypher 染色质读取器测定: 测量生理学染色质相互作用的同质生化测定。该测定利用 Perkin Elmer 的 AlphaScreenTM 技术，能够定量评估读取器结构域与核小体的相互作用(图1A)。同质的“混合和测量"性质，没有洗涤步骤，高灵敏度和稳健的方法使其成为询问低亲和力染色质读者-核小体相互作用的理想选择。HP1 something 是一个已建立的 H3K9甲基读取子2，与单甲基、二甲基和三甲基结合(图1B)。然而，当呈现 EpiCypher 设计者核小体(dNucs)时，HP1 something 仅对 H3K9me3显示显着增强的特异性(图1C)。这些发现强调了在生物相关的核小体背景下研究表观遗传阅读器相互作用的重要性。这里描述的协议允许终端用户优化 dCypher 染色质阅读器分析，首先使用 GSTtagedBRD4Bromodomain 1(BD-1)作为一个健壮的控制。然后，该方案可以容易地适应各种感兴趣的表观遗传阅读器结构域，不同的蛋白质标签(例如 GST，His 或 FLAG) ，并且与 EpiCypher 不断扩大的物素化核小体组合兼容。此外，这种方法可以用来计算 Kd 表面积，以更准确地比较相似的阅读器和核小体结合对。图1: 分析原理。用 dCypher 方法询问染色质阅读器。(A)将物素化的核小体固定在链霉亲和素供体珠上，并且通过抗标签缀合的 α 受体珠识别表位标记的染色质读取器。供体的激光激发产生单线态氧，扩散激活受体的发射。荧光计数与核小体-读取器相互作用桥接的供体-受体数量成正比。(B) HP1 something (0.15 nM)与物素化组蛋白肽的结合。(C) HP1 something (1nM)与物素化核小体的结合。

DCypher: 以高灵敏度和特异性询问染色质读数器鉴定和评估读数器与核小体结合的测定

测定缓冲液120mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSAadd 0.01% NP-40和1mM DTT 新鲜度测定缓冲液220mM Hepes pH7.5,250mM NaCl，0.01% BSA,添加0.01% NP-40新鲜标准协议注意: 在加入每种试剂后简要地离心平板(≤800xg? 10秒)以最大限度地提高重现性 * 不要旋转或超声处理核小体溶液 * * 为了确定感兴趣的读取蛋白的最佳浓度，首先用已知的阳性和阴性对照进行滴定(例如图2) * * * AlphaScreen 供体珠对光敏感，应该在柔和的照明下处理。* * * * 当使用镍螯合受体珠时，建议使用10μg/mL SA 供体珠和2.5 μg/mL 受体珠。加入5μL 在测定缓冲液12中制备的4X 核小体 * (10nM 最终)。加入5μL 在测定缓冲液1 * * 3中制备的4X 染色质读数器。在 RT4孵化30分钟。在 DARK * * * 准备的测定缓冲液2 * * * * 5中加入10μL 2X 链霉亲和素供体珠(5μg/mL)和谷胱甘受体珠(2.5 μg/mL)。在 RT6孵化60分钟。阅读使用阿尔法板读取器: Ex680nm，Em 520-620nm

图2: 蛋白质滴定法。在测试核小体文库之前，读取器结构域的最佳筛选浓度可以通过用已知靶核小体和阴性对照进行滴定来确定。对于 BRD4 BD-1，评估结合未修饰(rNuc，EpiCypher # 16-0006)和四乙酰化(H4K5,8,12,16 ac，EpiCypher # 16-0313)核小体。理想的浓度范围是30-200nM，提供足够的信号超过背景和下面的钩点(点信号开始下降后饱和的检测试剂)。问: 如果我感兴趣的读者领域没有已知的目标，或者如果我发现与组蛋白肽发现的已知的结合相互作用没有在核小体上重现，我该怎么办? 答: EpiCypher 科学家对不同类别的读者领域和实验优化有广泛的经验。请与我们联系，建立一个科学！

图3: BRD4 BD-1与 DCYPHER 核小体 K-ACYLSTAT 面板的结合。 EpiCypher 具有不断扩展的核小体文库，具有单独和组合修饰。使用100nM 蛋白质评估 BRD4 BD-1与 dCypher K-AcylStat 面板的结合(参见图2)。BRD4 BD-1对 H4K5,8,12,16 ac 具有特异性，对 H4上的个别乙酰修饰或 H3上的酰基修饰具有最小的结合。

用于染色质重塑研究的全重组核小体底物

概述染色质重塑，或核小体的重新定位，调节 DNA 通路，从而基因表达和基因组修复。许多 ATP 依赖性重塑酶复合物与人类疾病有关，但由于对基于核小体的底物的需求，是具有挑战性的研究目标。EpiCypher 通过开发全重组重塑底物 EpiDyne 平台来监测核小体沿 DNA 的重新定位，从而满足了这一需求。在这里，我们证明了 EpiDyne-FRET 在使用荧光共振能量转移(FRET)读数的均匀重构分析中的应用。

染色质重塑作为治疗目标异常的核小体组织能够严重破坏基因表达、 DNA 修复和细胞分化，并且在人类疾病中发挥重要作用，包括癌症、炎症、自身免疫、精神分裂症、心血管疾病和智力障碍。值得注意的是，近20% 的癌症都包含来自 SWI/SNF 家族的 ATP 依赖性染色质重塑复合物的亚基突变。这些酶复合物通过“泵"组蛋白八聚体周围的 DNA 来调节局部基因组的访问，从而“滑动"核小体[1]。在多种癌症中观察到 SWI/SNF 亚基的复发性体细胞突变，支持肿瘤发生的驱动作用[2]。突变重塑蛋白是有吸引力的治疗靶点，因为进一步降低其 ATP 酶活性促进癌细胞死亡，但节省正常细胞[2,3]。这种现象被称为合成致死性，鉴定利用它的抑制剂可能导致具有癌症特异性的药物[4,5]。

染色质重塑检测使用重组单核小体底物埃皮塞弗已经开发了表达式-荧光共聚染色质重塑酶复合物来研究其功能。核小体由包裹在 ~ 147bp DNA 中的核心组蛋白八聚体组成，代表染色质的基本重复单位。EpiDyne-FRET 由包裹在5’Cy3标记的 DNA 中的末端定位的组蛋白八聚体(H2AT120C * Cy5)组成[8](图1)。在其组装的起始位置，Cy3-Cy5 FRET 最大，当组蛋白八聚体重新定位(向模板 DNA 3’末端)或喷射时，通过 Cy5信号的丢失检测到核小体重塑。图1: EPIDYNE-FRET 核小体重塑底物由5’Cy3标记的 DNA (217bp; 绿色球)包裹的 Cy5标记的人组蛋白八聚体(H2A T120C-Cy5; 显示为八聚体的红色部分)组成，包括与核小体组装难治性的 TGGA 重复区相邻的末端核小体定位序列(147bp Widom 601[7])[8]。在组装起始状态下，Cy3-Cy5 FRET 达到最大值。当 Cy3标记的 DNA 5’末端从 Cy5标记的八聚体移开时，通过 FRET 信号的还原检测 ATP 依赖性重塑剂(例如 RSC 或另一种 SWI/SNF ATP 酶)的活性。EpiDyne-FRET 是一种与 HTS 应用立即兼容的一步免洗方法。

测定所需的试剂和材料[见注(i)]•酵母 RSC [9](底物也与 dACF [ ACF-ISWI ] ，dNoRC [ Toutatis-ISWI ]和人 SMARCA2/4(BRG1/BRM)相容; 数据未显示)• EpiDyne-FRET 核小体重塑底物(EpiCypher 目录号16-4201)•测定缓冲液(20mM Tris pH 7.5,50mM KCl，3mM MgCl 2和0.1 mg/mL BSA (Sigma 目录号。A3059)• ATP (Invitrogen 目录号。PV3227)•可选: ATPγS (一种非水解形式的 ATP)• Corning 3820384孔测定板(Fisher Catalog No. 07-200-891)•用于384孔板的16通道多频仪•384孔荧光微板读数器能够进行 Cy3/Cy5-FRET 检测(例如 Envision，Perkin Elmer)标准协议1。根据预期的时间点/重复(一式三份)确定所需的 RSC (10nM 最终) ，EpiDyne-FRET (20nM 最终)和 ATP (2mM 最终)的量[参见注释(ii & iii)]。准备反应组分(室温)。I. 2x 酶/底物溶液(20nM RSC + 40nMEpiDyne-FRET 底物在2x 测定缓冲液中)。2x ATP +/-抑制剂溶液(所需的 ddH2O + 抑制剂[例如 ATPγS ]中的4mM ATP)3。加入5μL 的2倍酶/底物溶液到微孔板上。4。通过加入5μL 的2xATP +/-抑制剂溶液来启动反应。5。在适当的时间点，在384孔板读取器中读取，能够检测到 Cy3(激发 -531nm/发射 -579nm)/Cy5(发射 -685nm)。数据表示为原始 Cy3和 Cy5发射信号在每个时间点的比值[8]。

注意事项(i)把蛋白样本贮存在摄氏零下80度，并避免冷冻/解冻。(ii)对于测定开发，建议对多种反应组分(包括酶、底物和 ATP)的浓度进行滴定。(iii)由于数据表示为 Cy3-Cy5发射，因此重要的是不要在这些反应中添加多余的底物。(iv)反应可迅速开始。如果设置一个大板没有一个自动注射器有没有一个能力的 T0为每个条件。2018年，NC。所有权利保留  由染色质重塑复合物 NURF 介导的 ATP 依赖性组蛋白八聚体滑移。1999年的牢房。97(7) : p. 833-42.2.SMARCA2/4 ATP 酶结构域在 SWI/SNF 突变型癌症中超越 Bromodomain 作为药物靶点: 来自 cDNA 拯救和 PFI-3抑制剂研究的见解。巨蟹座，2015年。75(18) : p. 3865-78.3.针对染色质重塑 BRG1增加了化药物在乳腺癌细胞中的疗效。肿瘤目标，2016年。7(19) : p. 27158-75.4.Helming，K.C. ，X. Wang，and C.W. Roberts，突变 SWI/SNF 复合物在癌症中的脆弱性。癌细胞，2014年。26(3) : p. 309-17.5.Karnezis，A.N. 等，SWI/SNF 复合物 ATP 酶 SMARCA4/BRG1和 SMARCA2/BRM 的双重丧失对于卵巢高钙血症型小细胞癌是高度敏感和特异性的。JPathol 2016年。238(3) : p. 389-400.6.Clapier，C.R. ，等，染色质重塑者 RSC/Sth1中 DNA 易位效率的调节增强核小体的滑动和射出。Mol Cell，2016年。62(3) : p. 453-61.7.Lowary 和 J.Widom，高亲和力结合组蛋白八聚体的新 DNA 序列规则和序列定向核小体定位。J Mol Biol 1998年。276(1) : p. 19-42.8.等人，TGGA 重复损害核小体的形成。J Mol Biol 1998年。281(2) : p. 253-60.

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